冠状病毒怎么检测?
目前对于新型冠状病毒(2019-nCoV)的检测主要采用实时荧光RT-PCR技术,通过检测呼吸道标本中病毒RNA的表达量是否为阳性来确定病人是否存在感染状况。
整个检测过程包括样品采集、核酸提取、反转录酶活性测定、聚合酶链反应扩增和判读。 每一个环节都需要严格控制,确保结果的准确性与稳定性。 下面将简单介绍上述各个环节的内容。
一、样品的采集 呼吸道标本(如鼻腔和咽喉部分泌物)是检测病毒的常规样本来源,而粪便或尿液等样本也可用于监测。采集过程中应注意无菌操作,尽量减少样品污染。
二、核酸提取 核酸提取是病毒检测的关键步骤之一,目的是从样本中提取出病毒基因组DNA。本实验采用QIAamp Virus Mini Kit(Qiagen Corporation,Hilden,Germany)从样本中分离出病毒基因组DNA。
三、逆转录酶活性定 除了核酸提取环节外,另一影响结果准确性的因素是逆转录过程是否稳定。若温度偏低导致逆转录酶活性降低,则会造成cDNA合成量不足;反之,过高温度会导致cDNA序列发生偏差甚至断裂。我们采用PrimeScript RT reagent Kit (Takara Bio Inc. Otsu, Japan) 对RNA进行逆转录反应,在特定条件下控制逆转录过程中的温度上升幅度和时间,以确保cDNA合成的质量和数量。
四、聚合酶链反应扩增 以特异性引物和探针检测靶基因,利用PCR方法进行大量扩增,可提高检测敏感性。本实验选择N蛋白基因作为目的基因进行扩增,目的片段长度约为384bp。
五、结果判定 目前临床上常采用荧光定量 PCR 方法对检测结果进行评定。该法可在PCR反应结束时快速判断阳性、阴性结果,也可通过对循环数(CT值)的计算确定样本中的病毒载量水平。 CT值等于样本的荧光强度到达设定阈值时所经历的循环数。一个理想的CT值应该是小于30的整数,说明实验结果是稳定的、可信的,数值越低则表明病毒含量越高。 由于病毒存在周期性和变化性,一次检测结果不一定能够完全反映患者体内的真实病情情况。同一患者应在不同时间间隔采集多份样本进行检测,以获得较可靠的结果。